CoverLogo (46)_edit

เทคนิคแยกวินิจฉัยชนิดเปปไทด์ ช่วยทำนายผลตรวจโรคร้ายได้รวดเร็วขึ้น

การจับกันของโปรตีนนั้นมีบทบาทสำคัญในทุกกระบวนการของเซลล์ร่างกาย ดังนั้นความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับการจับกันของโปรตีนเกิดจากการเชื่อมติดด้วยพันธะเปปไทด์ทั้งในด้านคุณภาพและปริมาณ อาจจะส่งผลให้เกิดความผิดปกติต่อการทำงานของเซลล์และเป็นสาเหตุทำให้เกิดโรคได้ เช่น โรคมะเร็ง เป็นต้น แต่จะแยกและวิเคราะห์เปปไทด์ที่จับกันเป็นโครงสร้างสลับซับซ้อนอย่างไร สามารถติดตามได้จากบทความนี้

โปรตีนเป็นสารชีวโมเลกุลที่มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับสิ่งมีชีวิตทุกชนิดทั้งในระดับเซลล์เดียวและระบบเครือข่ายระหว่างเซลล์ มีหน้าที่เกี่ยวข้องในกระบวนต่างๆ เช่น การส่งสัญญาณระหว่างเซลล์ การขนส่งสารออกนอกเซลล์ กระบวนการเมตาบอลซิม เป็นต้น การทำงานของโปรตีนโดยส่วนใหญ่มักอยู่ในรูปแบบการจับกัน (protein-protein interaction) เป็นโครงสร้างสลับซับซ้อน (protein complexes) เพื่อทำหน้าที่จำเพาะ การจับกันของโปรตีนนี้เองเป็นปัจจัยสำคัญที่ทำให้โปรตีนในเซลล์มีการทำหน้าที่ที่หลากหลายยิ่งขึ้น แต่หากการจับกันของโปรตีนหรือเปปไทด์เชื่อมติดกันนี้เกิดความผิดปกติทั้งในด้านคุณภาพและปริมาณ อาจจะส่งผลต่อการเกิดโรคร้ายได้ เช่น Creutzfeldt-Jakob disease, Alzheimer’s disease และโรคมะเร็ง เป็นต้น

Peptide-based approaches เป็นเทคนิคที่ได้ถูกนำมาใช้ในการแยกบริสุทธิ์เปปไทด์* ที่ถูกเชื่อม โดยอาศัยคุณสมบัติทางเคมีและกายภาพที่แตกต่างกันของเปปไทด์ที่ถูกเชื่อม เช่น มวลโมเลกุล และประจุรวม ซึ่งการแยกบริสุทธิ์โดยมวลโมเลกุลนั้นสามารถทำได้โดย เทคนิค size exclusion chromatography (SEC) ส่วน การแยกเปปไทด์ด้วยประจุรวมนั้น สามารถทำได้โดยใช้เทคนิค strong cation exchange chromatography (SCX) ซึ่งจะอาศัยการทำให้เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมแสดงประจุบวก แต่ก็ยังมีปัญหาที่ถูกขัดขวางด้วยกรดอะมิโนฮีสทีดีนที่สามารถแสดงประจุบวกในสภาวะกรดได้เช่นกัน ดังนั้นเทคนิค SCX สามารถแยกบริสุทธิ์เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมได้แค่บางส่วนเท่านั้น

*เปปไทด์ คือสายพอลิเมอร์ของกรดอะมิโนที่มาเชื่อมต่อกันด้วยพันธะเปปไทด์

การแยกและวิเคราะห์เปปไทด์

การศึกษานี้มีจุดประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีแยกเปปไทด์บริสุทธิ์ที่ถูกเชื่อมด้วยเทคนิค SCX ขั้นตอนการทดลอง จะแยกเป็น 2 ส่วน
โดยในส่วนที่ 1 มี 2 ขั้นตอน ในขั้นตอนที่1 การย่อยเปปไทด์ด้วยเอนไซม์ trypsin/Lys-C และ เอนไซม์ Arg-C เพื่อลดการรบกวนจากกรดอะมิโนไลซีนหรืออาร์จินีน
ขั้นตอนที่2 การป้องกันการแสดงประจุบวกของกรดอะมิโนฮิสทิดีนโดยการทำปฏิกิริยากับ diethylpyrocarbonate (DEPC) ซึ่งขั้นตอนนี้ เป็นการดัดแปลงหมู่ฟังก์ชั่นของกรดอะมิโนฮีสทิดีนด้วยปฏิกิริยา acetylation เพื่อทำให้ เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมสามารถใช้เทคนิค SCX แยกเปปไทด์บริสุทธิ์ได้

ทั้งนี้จากการทดลองในส่วนที่ 1 พบว่าการแยกเปปไทด์ด้วยเทคนิค DEPC-SCX เป็นวิธีการที่อาศัยการย่อยโปรตีนเป้าหมายที่มีเปปไทด์เป็นพันธะเชื่อมติดโดยใช้เอนไซม์ trypsin/Lys-Cและ เอนไซม์ trypsin/ Arg-C ซึ่งเป็นขั้นตอนการย่อยโปรตีนเป้าหมายด้วย เอนไซม์ trypsin สามารถแยกเปปไทด์ชนิดต่างๆออกจากกรดอะมิโนในสภาวะกรดได้ และการป้องกันการแสดงประจุบวกของกรดอะมิโนโดยการทำปฏิกิริยากับ DEPC พบว่า อัตราส่วนโดยโมลของ DEPC:กรดอะมิโนฮิสทิดีน(peptide B) เทียบกับ DEPC:กรดอะมิโนไลซีน(peptide A) ที่ 5:1 พบว่า peptide B ก่อนถูกดัดแปลงด้วย DEPC มีประจุ2+ หลังจากถูกดัดแปลงด้วยDEPC ส่งผลให้ไม่มีการรับโปรตอนของกรดอะมิโน ทำให้ประจุรวมของเปปไทด์มีค่า บวกลดลง เป็น1+ ส่งผลให้เปปไทด์ที่ถูกดัดแปลงด้วย DEPC ถูกชะออกจากคอลัมน์ได้เร็วขึ้น(รูปกราฟ1B)และแยกเปปไทด์บริสุทธิ์ที่ถูกเชื่อมออกมา พบว่าเปปไทด์ที่แยกได้เป็นเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมเนื่องจากมีประจุรวมมากกว่า2+(เปปไทด์ปกติประจุรวมสูงสุดเท่ากับ2+ และเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมจะมีประจุรวมมากกว่า 2+ ซึ่งเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมนี้เองที่มีบทบาทสำคัญต่อการทำงานของเซลล์ต่างๆในร่างกาย) จากนั้นทำการทดลองการผันกลับของกรดอะมิโนฮิสทิดีนที่ถูกดัดแปลงด้วย DEPC ไปเป็นกรดอะมิโนฮิสทิดีนที่ไม่ถูกดัดแปลงโดยทำปฏิกิริยากับ hydroxylamine พบว่า กรดอะมิโนฮีสทิดีนที่ถูกดัดแปลงด้วย DEPC สามารถผันกลับสู่สภาพเดิมได้อย่างสมบูรณ์ ในขณะที่ไม่มีการผันกลับของกรดอะมิโนไลซีนที่ถูกดัดแปลงด้วย DEPC เกิดขึ้น

และพบว่าการย่อยโปรตีนเป้าหมายด้วยเอนไซม์ trypsin/Lys-C และ เอนไซม์ Arg-C ทำให้ ประจุบวกโดยรวมของเปปไทด์ลดลง ส่งผลให้เปปไทด์ตัวอย่างถูกชะออกจากคอลัมน์ SCX ได้เร็วกว่าก่อนถูกแปลงด้วย DEPC วิธีดังกล่าวสามารถแยกเปปไทด์เป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยพบว่า การย่อยโปรตีนเป้าหมายด้วยเอนไซม์ trypsin/Lys-C และ เอนไซม์ Arg-C ซึ่งลดการรบกวนของประจุของกรดอะมิโนไลซีนและอาร์จินีนได้ และป้องกันการรบกวนจากกรดอะมิโนฮีสทิดีนด้วยการทำปฏิกิริยากับไดเอทิลไพโรคาร์บอเนต(DEPC) ส่งผลให้ประจุบวกโดยรวมของเปปไทด์ลดลง และถูกชะออกจากคอลัมน์ SCX ได้เร็วกว่าก่อนถูกดัดแปลงด้วย DEPC

ในส่วนที่ 2 เป็นการพัฒนาคอลัมน์ที่ใช้ในการแยกเปปไทด์ โดยใช้เถ้าลอย เพื่อแยกเปปไทด์บริสุทธิ์ที่ถูกเติมหมู่ฟอสเฟต โดยสร้างคอลัมน์ที่ใช้เป็นอุปกรณ์ในการแยกเปปไทด์ จากเถ้าลอยที่มีราคาถูก ซึ่งประกอบด้วย ออกไซด์ของโลหะ เช่น ไททาเนียมออกไซด์ อะลูมิเนียมออกไซด์ เป็นต้น ซึ่งออกไซด์ของโลหะมีความสามารถที่จับอย่างจำเพาะกับเปปไทด์ที่ถูกเติมหมู่ฟอสเฟต ในการศึกษานี้ทำการทดลองกับโปรตีน 3 ชนิด ได้แก่ beta-casein ซึ่งเป็นโปรตีนที่ถูกเติมหมู่ฟอสเฟต และ BSA และ myoglobin ซึ่งเป็นโปรตีนที่ไม่มีหมู่ฟอสเฟต ได้ถูกผสมกันในอัตราส่วน 1:1:1 จากนั้นเติมโปรตีนผสมข้างต้นในคอลัมน์เถ้าลอย(50 mg) จากนั้นทำการชะโปรตีนที่จับกับเถ้าลอยด้วยแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์

จากการทดลองการแยกเปปไทด์เป้าหมายที่ถูกดัดแปลงด้วยหมู่ฟังก์ชันที่เปลี่ยนแปลงประจุรวมของเปปไทด์ เช่นการเติมหมู่ฟอสเฟตแก่หมู่ข้างของกรดอะมิโน จะส่งผลให้ประจุโดยรวมมีค่าทางบวกที่ลดลง ส่งผลให้เปปไทด์เหล่านี้ไม่สามารถถูกแยกด้วย DEPC –SCX ได้ เนื่องจากเกิดการถูกชะของเปปไทด์ที่เร็วเกินไปกว่าที่ควรจะเป็น ผู้วิจัยจึงได้พัฒนาคอลัมน์จากเถ้าลอยเพื่อจับกับโปรตีนและเปปไทด์เป้าหมายเพื่อใช้ในการวิเคราะห์การเชื่อมกันของเปปไทด์ อีกทั้งเถ้าลอยยังมีราคาที่ถูก ผลการทดลองพบว่า คอลัมน์เถ้าลอยสามารถแยก beta-casein ซึ่งเป็นโปรตีนที่ถูกเติมหมู่ฟอสเฟต ออกจาก BSA และ myoglobin ซึ่งเป็นโปรตีนที่ไม่มีหมู่ฟอสเฟต ได้อย่างจำเพาะ ดังแสดงผลการแยกโปรตีนผสมตามรูปด้านล่างนี้

ประโยชน์ที่ได้รับ และแนวทางการนำไปใช้ในอนาคต

งานวิจัยนี้ค้นพบเทคโนโลยีในการแยกเปปไทด์ทีมีการเชื่อมต่อกันในสายโซ่ของกรดอะมิโนเพื่อนำไปใช้วิเคราะห์หาลำดับของเปปไทด์ ทั้งในเชิงปริมาณและคุณภาพ เนื่องจากเปปไทด์ดังกล่าวมีบทบาทหน้าที่ที่สำคัญต่อการทำงานของเซลล์ร่างกาย หากตรวจพบความผิดปกติของเปปไทด์ เช่นมีการเชื่อมกันของเปปไทด์ที่ผิดตำแหน่ง เป็นต้น อาจส่งผลให้เกิดโรคที่รุนแรงถึงขั้นเสียชีวิตได้ โดยเฉพาะโรคมะเร็งที่เป็นสาเหตุมาจากการทำงานที่ผิดปกติของเปปไทด์ เป็นโรคที่คร่าชีวิตผู้คนไปแล้วอย่างมากมาย หากมีการทราบผลวินิจฉัยถึงความผิดปกติที่รวดเร็ว ที่ได้แนวทางการวิเคราะห์จากงานวิจัยนี้ จะช่วยทำให้หาแนวทางการรักษาได้อย่างทันท่วงที และสามารถเป็นแนวทางในการตรวจวินิจฉัยโรคได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำมากขึ้น

อ้างอิงข้อมูลจาก

โครงการวิจัย “การแยกบริสุทธิ์เปปไทด์ที่ถูกเชื่อมติดกันโดยเทคนิคการย่อยด้วยหลายเอนไซม์ร่วมกับปฏิกิริยาเคมีไอเอทิลไพโรคาร์บอเนต”

หัวหน้าโครงการ : หาญศึก บุญเชิด
สนับสนุนโดย : สำนักงานคณะกรรมการส่งเสริมวิทยาศาสตร์ วิจัยและนวัตกรรม (สกสว.)

เรียบเรียง ไพรินทร์ ตันติวิชยานนท์
กราฟิก ไพรินทร์ ตันติวิชยานนท์

 

 

 

 

00:00
00:00
Empty Playlist